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T3 RNA聚合酶是一种高度特异识别T3启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。T3 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T3启动子下游NTP的掺入，合成与T3启动子下游的模板DNA互补的RNA。

T3 RNA聚合酶不仅可以进行常规的RNA合成，还可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T3启动子有高度的特异性。

用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。


由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体T3 RNA Polymerase基因。


1个活性单位是指37℃条件下，60分钟内，催化1nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量。
活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl₂，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，0.6MBq/ml [³H]-ATP，20μg/mL plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。

组分	1kU	5kU	25kU	100kU
T3 RNA Polymerase (50U/μL)	20μL	100μL	500μL	2mL
10×T3 Transcription Buffer	25μL	120μL	600μL	1.2mL×2

保存：-20℃


50mM Tris-HCl (pH7.9@25℃),100mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA,50% (v/v) Glycerol,0.1% (w/v) Triton X-100。


10×T3 Transcription Buffer：
400mM Tris-HCl (pH7.9@25℃),20mM spermidine,60mM MgCl₂,10mM DTT。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

• 70℃加热10分钟可使T3 RNA Polymerase失活。
  
• 加入适量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。
  
• 螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T3 RNA Polymerase的活性。

T3 consensus promoter sequence如下，其中的G为转录的第一个碱基。
AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA



图1.本制品与N公司的同类产品以带有T3 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行体外转录时的效果图。在20μL反应体系(40mM Tris-HCl,pH7.9,2mM Spermidine,6mM MgCl₂,1mM DTT)中，加入0.2μg线性化质粒DNA，以及图中指定量的本制品或N公司的T3 RNA Polymerase，37℃孵育2h，70℃孵育10min终止反应，加入2U DNase I溶液，37℃孵育15min消化模板DNA，得到的RNA转录产物为221nt。取出5μL反应产物，加入5μL 2×RNA Loading Buffer，70℃变性10min，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，用1×TAE作为电泳液，170V电泳5min，染色后拍照观察结果。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有相近或略优的转录效果。

• RNA合成：
  
  • DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
    
  • 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如产物DNA纯化试剂盒，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
    
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    10×T3 Transcription Buffer	2μL
    NTP Mixture (10mM each)	4μL
    线性DNA模板	0.2～1μg
    RNase抑制剂(40U/μL)	0.5μL
    T3 RNA聚合酶(50U/μL)	0.8～2μL
    经DEPC处理的去离子水	至20μL

  • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 37℃孵育1～2个小时。
    
  • 加入2μL 0.5M EDTA (pH8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
    
  • 电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
  • 转录需在无RNA酶条件下进行。
    
  • 反应体系需在室温条件下配置，4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
    
  • 按以上反应条件，每1μg模板DNA可合成超过10μg的RNA。
    
  • 如果模板DNA的线形化不太完全，会导致转录出比预期长度更长的RNA，同时使预期长度的转录本比例下降。
    
  • 可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。
• 放射标记RNA的合成：
  
  • DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
    
  • 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如产物DNA纯化试剂盒，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
    
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    10×T3 Transcription Buffer	2μL
    3 NTP Mixture (10mM each,without CTP)	1μL
    100μM CTP	2.4μL
    [α-32P]-CTP,~30TBq/mmol(800Ci/mmol)	1.85MBq(50μCi)
    线性DNA模板	0.2～1μg
    RNase抑制剂(40U/μL)	0.5μL
    T3 RNA聚合酶(50U/μL)	1μL
    经DEPC处理的去离子水	至20μL

  • 37℃孵育1～2个小时。
    
  • -20℃冷却终止反应。
    
  • 分析和检测RNA的标记效率。
  • 按以上方法合成的RNA活性一般为3～5×10⁸ dpm/μg。
    
  • 上述标记反应中也可以使用[³² P]、[³⁵ S]或[³H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时，其他的NTP需作相应调整。20μL反应体系各成分推荐使用剂量分别为：

    1.85MBq (50μCi) 5'-[α-32P]-CTP	~30TBq/mmol(800Ci/mmol)；
    11.1MBq (300μCi) 5'-[α-35S]-UTP	＞37TBq/mmol (＞1000Ci/mmol)；
    0.925MBq (25μCi) 5,6-[3H]-UTP	1.1-2.2TBq/mmol (30-60Ci/mmol)。

  • 放射性标记NTP浓度低于12μM时，全长转录本合成效率也会下降。
• 生物素标记、地高辛标记等其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

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